1、蛋白质浓度的测定
(相关资料图)
2、按照50: 1配置BCA工作液。10ulC溶液(蛋白质标准)90ulPBS溶液稀释成0.5mg/ml蛋白质标准溶液。然后将蛋白质标准溶液分别以0、1、2、4、8、12、16和20ul加入96孔板的第1至第8个标准孔中。
3、在其他样品孔中加入10微升待测样品。加入PBS分别固定体积至20ul。向每个孔中加入200ulBCA工作溶液，并在室温下放置2小时。酶联免疫吸附法测定蛋白浓度：测定A562，根据标准曲线计算蛋白浓度。
4、SDS-PAGE电泳
5、1制胶：
6、按比例配制分离凝胶，缓慢摇动溶液使活化剂混合均匀，将凝胶溶液轻轻注入两层玻璃电极中，然后在液面小心注入一层水，防止氧气进入凝胶溶液，静置40min。如前所述按比例配制浓缩胶，
7、但不要过于剧烈地混合溶液，以免引入过多的氧气。在不连续体系中吸收下层分离胶中的水分，连续稳定地注入凝胶溶液，然后小心地插入梳子并注意不要在齿尖留下气泡，静置60分钟以上以确保完全聚合。
8、2.预电泳：将聚合好的凝胶放入电泳槽中，小心地取下梳子，加入电泳缓冲液后，用10-20V的低电压预电泳20-30分钟。(目的是去除凝胶中的杂质，
9、疏通凝胶的孔径，保证电泳时电泳顺畅)。
10、样品制备：先计算样品体积，然后按样品：样品缓冲液=4: 1的比例加入样品缓冲液，混匀，沸水中煮沸10分钟，冷冻5分钟。
11、4样品添加：
12、预电泳后，依次加入标记物和待分析的样品。(加样时间尽量短，避免样品扩散，可在无样品的孔中加入等量的样品缓冲液，避免边缘效应。每个通道5ul。
13、5电扫描：
14、加样后，在80V的恒压下进行电泳，直到溴酚蓝染料前沿到达两块凝胶的交界处(一般约20分钟)，然后改为100V的恒压电泳，直到溴酚蓝染料前沿下降到凝胶末端时(一般约1小时20分钟)停止电泳。
15、膜的密封
16、用TBST溶液清洗印迹膜10分钟2次。放入5%BSA(abs49001012)密封液中，摇床，70 rpm，室温密封1小时30分钟。
17、蛋白质的样品制备
18、取心肌组织50mg，待组织块自行溶解时，用滤纸吸去表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器的球形部分，用组织剪尽可能剪下，将剪下的心肌组织放入玻璃匀浆器的棒状部分。
19、按照1mlRIPA 10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先RIPA后PMSF)，将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。
20、将心肌组织匀浆转移到离心管中，412000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20备用。
本文到此结束，希望对大家有所帮助。
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